Molecular Cell发文！z6尊龙官方网站生物团队开发出一种高活性、体积更小的新型基因编辑工具

Molecular Cell 发文

以CRISPR/Cas9为代表的技术自被发现的十年来屡屡获奖，已成为当前炙手可热的基因编辑工具，为基础生物学和疾病治疗带来了重大变革。特别是从2023年底到2024年初，全球首款基于CRISPR的离体（ex vivo）基因编辑疗法CASGEVY™相继在英国、美国、沙特及欧盟等4个国家获批，标志着CRISPR真正走出了实验室。然而，CRISPR/Cas9系统仍然存在着一定的局限性，如体积较大导致在体（in vivo）基因疗法受到限制，又如适用于肝外基因递送的主要载体是包装上限约4.7kb的腺相关病毒（AAV），单个病毒难以递送Cas9等核酸酶及其衍生编辑系统，因此寻找尺寸更小的高活性基因编辑系统对于实现安全高效的体内递送具有重要意义。

2021年，张锋团队通过挖掘和分析发现了一种由IS200/IS605转座子超家族编码名为IscB的核酸酶。作为Cas9可能的进化祖先，氨基酸长度仅约为SpCas9的三分之一左右，也利用一段非编码RNA（ωRNA）引导蛋白识别DNA。然而，当时所报道的IscB在哺乳动物细胞中的活性非常有限。以OgeuIscB为例，其在HEK293FT细胞中编辑效率不到5%。因此，能否通过工程化的改造提高IscB的基因编辑活性，达到与Cas9相当的活性是需要解决的首要问题。

为了提高IscB蛋白活性，研究团队通过蛋白质工程化改造、RNA结构优化、胚胎注射等技术，成功获得在人类细胞以及鼠源细胞系中具有超高编辑活性的IscB变体（eIscB-D）。首先，基于结构理性设计在关键位置引入突变，经过三轮迭代筛选，成功获得增强型IscB（命名为eIscB）。eIscB相较于野生型IscB编辑效率最高可以提升22.4倍，平均编辑效率可提高7.5倍。此外，研究者通过融合一个非序列特异性DNA双链结合蛋白（HMG-D）提高了IscB与目标DNA的亲和力，高活性IscB（eIscB-D）的最高编辑效率可达91.3%。值得一提的是，在此基础上，研究者还针对向导RNA进行优化改造，获得高效ωRNA（命名为eωRNA），且长度相较于野生型ωRNA缩短了约20%，不仅降低了工业合成的难度，且明显降低了生产成本。并且，eIscB-D/eωRNA编辑效率相比原始IscB/ωRNA平均提升20.2倍。总之，eIscB-D不仅体积更小，并且具有高编辑活性，是一种极具临床应用潜力的编辑系统。

此外，先前并没有研究证明IscB在小鼠体内可以产生高效编辑。研究者首先在小鼠N2a细胞系中针对PCSK9以及Tyr基因进行靶点筛选。测序结果表明eIscB-D在PCSK9-sg29这一靶点可实现58%的编辑效率，在Tyr-sg21靶点的编辑效率为47.1%。研究者随后通过胚胎注射eIscB-D/eωRNA系统靶向Tyr基因的1号外显子，破坏白化基因的表达，成功制备小鼠白化疾病模型。在F0代，75%（9/12只）突变小鼠实现高效编辑（平均编辑效率为58.8%），其中有5只产生编辑效率接近100%的白化表型。该研究首次证明了eIscB-D不仅可以在鼠源细胞系中产生高效编辑，并且可以通过胚胎注射高效制备疾病动物模型。

图：eIscB-D工具优化示意图及在小鼠体内高效编辑

近年来，陆续报道了一系列小型Cas蛋白，包括小型Cas12f蛋白、其进化上的祖先TnpB以及真核同源物Fanzor。然而，由于Cas12f家族只有一个RuvC结构域，需要形成二聚体才能发挥基因编辑功能，难于被用于开发碱基编辑器等衍生技术。

作为Cas9可能的进化祖先，IscB氨基酸链的长度仅约SpCas9的三分之一左右，普遍只有约400-500个氨基酸，因此，IscB有望与胞嘧啶脱氨酶（APOBEC）、腺苷脱氨酶（TadA）或逆转录酶（RT）形成体积较小的融合蛋白，构建可由单个AAV完整包装的迷你碱基编辑器（BE）或先导编辑器（PE），具有极大的临床应用潜力。

接下来研究团队通过在RuvC结构域关键催化位点引入丙氨酸突变开发了IscB切口酶（eIscB^H339A），并与腺苷脱氨酶（TadA-8e）和胞嘧啶脱氨酶（hA3A*）分别融合开发出超高活性的迷你单碱基编辑器eiABE和eiCBE，最高位编辑效率分别可达到73.6%和79.2%。

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